多肽基本信息

1.多肽合成的基本原理?
多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程,固相合成顺序一般从C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法,现在多采用固相合成法,它的最大特点是不必纯化中间产物,合成过程可以连续进行,进而为多肽合成的自动化奠定了基础。为了防止副反应的发生,参加反应的氨基酸的侧链都是被保护的;而羧基端是游离的,并且在反应之前必须活化。化学合成方法有两种,即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多优势,现在大多采用Fmoc法合成。
基于Fmoc化学合成,先将所要合成的目标多肽的C-端氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连,然后以这一氨基酸的氨基作为多肽合成的起点,同其它的氨基酸已经活化的羧基作用形成肽键,不断重复这一过程,即可得到多肽。根据多肽的氨基酸组成不同,多肽后处理方式不同,纯化方式也有差异。

2.多肽状态是如何?如何保存储存?
答:我们提供的多肽是粉末状,一般为灰白色,组成不同,多肽粉末的颜色有差异,多肽一般长期保存需要避光保存,并应保存在-20度以下,短期可以保存在4℃。可以短时间以室温运输。多肽在-20℃很稳定,特别是冷冻干燥并保存在干燥器中时。为了使湿度对冷冻干燥多肽的影响减少,建议在将它们暴露于空气之前, 可以放于室温自然升温,当无法冷冻干燥时,最好的方法是以小的工作样量存放。
对于含Cys, Met or Trp的多肽,脱氧缓冲剂对其溶解必不可少,因为这种多肽容易空气氧化, 在封瓶前,氮气或氩气保护会降低氧化作用。含Gln或Asn的多肽比较容易降解,所有这些肽与不含这些有问题的简单肽相比,保存期要短。

3.如何溶解多肽?
答:溶解多肽是非常复杂的事情,一般很难一下子确定合适的溶剂。多肽的溶解性很大程度上取决于多肽的极性。酸性的蛋白溶解于碱性溶液,而碱性蛋白可溶解于酸性溶液,含有大量不带电荷的极性氨基酸残基或疏水性氨基酸的疏水性多肽和中性多肽可先溶解于少量有机溶剂中,如DMSO、DMF、醋酸、乙腈、甲醇、丙醇或异丙醇,然后加水(蒸馏水)稀释。含有甲硫氨酸或半胱氨酸的多肽不能用DMSO溶解,因为DMSO可能造成侧链氧化。在多肽溶解之前通常是先取一点试验,在没有确定合适的溶剂前千万不要全部溶解。 下列方法有助于您选择合适的溶剂:
(1)判定多肽的电荷特定,设定酸性氨基酸Asp(D),Glu(E)和C端COOH为-1;碱性氨基酸Lys(K),Arg(R),His(H)及N端NH2为+1,其它氨基酸的电荷为0。计算出净电荷数。
(2)如果净电荷数 >0,多肽为碱性,用水溶解:如果不溶解或溶解性不大,加入醋酸(10%以上);如果多肽还不能溶解,加入少量TFA(25ul)溶解,然后加入500ul水稀释。
(3)如果净电荷数小于0,多肽为酸性,用水溶解;如果不溶解或溶解性不大,加入氨水(25ul)溶解,然后加入500ul水稀释。
(4)如果净电荷数=0,多肽为中性,一般需要用有机溶剂如乙腈,甲醇或异丙醇,DMSO等溶解。还有人建议需要尿素来溶解疏水性很大的多肽。

4.做免疫用的多肽多长为合适?
答:一般约10-15个氨基酸,当然长一些免疫效果好一些,不过合成费用也会增加。MAP多肽则希望长度在15aa以上,效果较好。另外,10aa以下的多肽免疫效果比较差。

5.免疫用多肽的纯度需要很高吗??
答:一般来说同样序列,同样数量的多肽会因为其纯度的不同而价格各异,纯度越高,单位质量的多肽价格也越高。三羊开肽生物科技有限公司可以提供不同的纯度级别供客户选择,从粗品到>98%纯度。根据客户需要我们可以提供纯度>98%的超纯多肽。
一般而言, 免疫用Peptide,70-85%即可。

6.我们合成的多肽溶解性不好,多肽就有问题对吗?
答:多肽溶解性不好,不代表多肽就有问题。因为很难准确预测一个多肽的溶解性及合适的溶剂是什么。

7.非HPLC纯化的多肽中有哪些杂质?
答:粗品和脱盐级别的多肽中多肽和非多肽类杂质:如非目标多肽和多肽后处理的一些原料如DTT、TFA等

8.HPLC纯化的多肽有哪些杂质?
答:经过HPLC纯化的多肽,仍会有一些杂质存在,其中的杂质主要是短肽和微量TFA。

9.多长的多肽最为合适?
答:多肽合成需要考虑多肽的长度,电荷,亲疏水性等因素。长度越长,合成粗品的纯度和产率都随着降低,纯化的难度变大,无法合成的几率也相应更大。当然多肽功能区的序列是无法改变的,但是为了多肽的顺利合成,有时不得不在功能区的上下游增加一些辅助氨基酸,以改善多肽的溶解性和亲疏水性。如果多肽太短,合成也可能有问题,主要问题是合成的多肽在后处理过程中有一定的难度,5肽以下的多肽,一般要有疏水的氨基酸,否则后处理难度加大。15个氨基酸残基以下的多肽一般都可以得到满意的产率和得率。

10.如何从多肽序列中判定多肽的溶解性?
答:通过研究肽的结构无法预测多肽在水中的溶解度。然而,Lys的ε-氨基和Arg的胍通常有助于估计肽的溶解度,特别是具有短序列的多肽。相反,含有Asp和Glu的酸性多肽往往不溶于水,但可以很容易地溶解在稀氨水或碱性缓冲液中。 以下某些基本特征可用于预测溶解度:
(1) 含有小于5个氨基酸的多肽通常可溶于水溶液中。然而,如果整个序列由疏水残基组成,它将仅具有有限的溶解度或可能完全不溶。
(2) 含有> 25%带电氨基酸(E,D,K,R和H)和小于25%疏水残基的亲水性多肽通常可溶于水溶液中。
(3)其序列含有≥50%疏水残基的疏水性多肽可以完全或仅部分溶于水溶液中。如果它们不含有C,W或M残基,则应将这些多肽溶解在有机溶剂如DMSO中。如果它们确实含有这些氨基酸,则应将它们溶解在DMF,乙腈,异丙醇,乙醇,乙酸,4-8M盐酸胍(GdnHCl)或尿素中,然后小心地在水溶液中稀释。
(4)包含> 75%疏水性氨基酸的疏水性多肽通常不溶于水性溶液。相反,必须使用非常强的溶剂如TFA或甲酸进行初始溶解。然而,当加入水性缓冲溶液中时,多肽可能会沉淀。因此,可能需要高浓度的有机溶剂或变性剂来溶解这些肽。
(5)包含非常高比例(> 75%)的D,E,H,K,N,Q,R,S,T或Y的多肽可形成分子间氢键(交联),这可导致凝胶形成在浓缩的水溶液中。因此,多肽应该溶解在与最终实验相容的有机溶剂中。在将肽溶解在有机溶剂中后,应将溶液缓慢(逐滴)加入搅拌的缓冲水溶液中。当所得肽溶液开始显示浑浊时,达到溶解度极限。

11.为什么含有Cys,Met,或Trp的多肽难合成?
答:含有Cys, Met,或Trp的多肽,基团不稳定,容易空气氧化,所以较难合成,同时难以获得高纯度的产品。这些多肽的使用和储存都需要特别注意,避免反复开启盖子。。

12.为什么有些多肽的合成产率或纯度会比较低?
答:多肽合成与引子合成有比较大的区别,不能合成的引子很少,但是不能合成的多肽经常有。如Val,Ile,Tyr,Phe,Trp,Leu,Gln,和Thr这些氨基酸比邻或重复时,多肽链在合成过程中不能完全舒展溶解,合成效率下降。以下几种情形,合成效率和产物的纯度都比较低,如:重复Pro,Ser-Ser,重复Asp,4个连续Gly等。

13.多肽是如何纯化的?
答:多肽纯化一般使用反相柱(如C8,C18等),214nm。缓冲体系通常为含TFA的溶剂,pH 2.0 。Buffer A为含0.1%TFA in ddH2O,Buffer B为1%TFA/ACN/ pH 2.0。根据多肽性质不同,选择不同比例的缓冲体系溶解。对疏水性强的多肽,有时还需要加入少量的Formic Acid或醋酸助溶。HPLC纯化多肽粗产物,如果目标多肽不长(15aa以下),一般目标多肽为主峰;对于20aa以上的长肽,如果主峰不是目标肽,需搭配MS来判定其他峰的分子量,进而确定哪个峰是所要的目标多肽

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